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全基因組或外顯子組測(cè)序的臨床應(yīng)用，稱為臨床基因組和外顯子測(cè)序，由于該技術(shù)檢測(cè)范圍廣，可以同時(shí)檢測(cè)2000多個(gè)基因的變異，對(duì)于臨床罕見病、疑難疾病、復(fù)雜疾病，特別是孟德爾遺傳病的診斷是一種強(qiáng)大而有效的方法
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全基因組或外顯子組測(cè)序的臨床應(yīng)用，稱為臨床基因組和外顯子測(cè)序( Clinical genome and exome sequencing，CGES）。由于該技術(shù)檢測(cè)范圍廣，可以同時(shí)檢測(cè)2000多個(gè)基因的變異，對(duì)于臨床罕見病、疑難疾病、復(fù)雜疾病，特別是孟德爾遺傳病的診斷是一種強(qiáng)大而有效的方法。
全基因組測(cè)序（Genome sequencing）是針對(duì)個(gè)體的所有基因序列進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序范圍廣，數(shù)據(jù)多，分析困難，專業(yè)性強(qiáng)，費(fèi)用昂貴，目前還難以大規(guī)模應(yīng)用于臨床。而外顯子組的序列只占全基因組序列的1%，大多數(shù)與疾病相關(guān)基因變異位于外顯子區(qū)域，因此，與全基因組測(cè)序相比，外顯子組測(cè)序（Exome sequencing）以其經(jīng)濟(jì)有效的優(yōu)勢(shì)廣泛用于鑒定遺傳性疾病的基因變異。但是，由于運(yùn)用該技術(shù)鑒別成因性變異的成功率僅約為25% ，這就使得臨床醫(yī)生了解該技術(shù)的基礎(chǔ)原理以及如何選擇最有可能從中受益的患者顯得非常重要，同時(shí)還應(yīng)該熟悉外顯子組測(cè)序的診斷適應(yīng)癥才能更加有效地運(yùn)用于臨床實(shí)踐。
1、 CGES的局限性
CGES是檢測(cè)單核苷酸替代、插入以及8-10個(gè)甚至更少的核苷酸缺失突變的最有效的方法，而對(duì)于拷貝數(shù)變異、染色體的非整倍體、長插入缺失變異、DNA重復(fù)序列等形式的基因變異則沒有那么精確。同時(shí)，不管是全基因組測(cè)序還是外顯子組測(cè)序都存在測(cè)序覆蓋率的問題，一般情況下，測(cè)序所得出的數(shù)據(jù)僅能覆蓋目標(biāo)序列的85~95%。因此，即便運(yùn)用全基因組測(cè)序，仍然存在致病性變異漏檢的可能。
2 、CGES的應(yīng)用
CGES是疑似罕見的孟德爾疾病的最佳診斷方法。當(dāng)患者已經(jīng)排除常見的單基因缺陷，同時(shí)又考慮到多基因缺陷的檢測(cè)方法太昂貴時(shí)，CGES就是最好的選擇。由于很多遺傳性疾病都是在童年出現(xiàn)臨床表現(xiàn)，因此實(shí)施CGES檢測(cè)的患者是以兒童為主，它不僅可能幫助患者及其家屬找到病因和疾病治療相關(guān)方法，同時(shí)還可以了解疾病的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。
若考慮患者需要做CGES檢測(cè)，測(cè)試前的咨詢至關(guān)重要。首先，最主要是要確定患者的真實(shí)期望，以及提醒患者或者家族成員：陽性的結(jié)果并不意味著一定可以改變治療方案和改善預(yù)后[9]。其次，還必須告訴患者，與欲檢測(cè)疾病不相關(guān)的基因突變也可能發(fā)現(xiàn)并出具于報(bào)告中。在大多數(shù)情況下，外顯子組測(cè)序較單個(gè)基因測(cè)序更加高效。
除此之外，醫(yī)生還需要準(zhǔn)備四個(gè)要素：收集家系的信息、系統(tǒng)評(píng)估患者的表型、查找醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫和簽署知情同意書。一份完整的家系可以用于評(píng)估家系其他成員中有沒有相似或者相關(guān)的表型，以確定疾病遺傳模式。同時(shí)，先證者和家系中的其他患者也必須排除其他的潛在相關(guān)的臨床表現(xiàn)。當(dāng)有了一個(gè)完整的家系資料、全面的表型特征、相關(guān)疾病的文獻(xiàn)綜述以及數(shù)據(jù)庫，便可以基本明確患者是否是患有罕見的遺傳病。
那么如何選擇家系中的成員進(jìn)行測(cè)序分析呢？這個(gè)和遺傳模式（顯性或者隱性）以及家系中的其他成員是否具有相類似的臨床表現(xiàn)有關(guān)。當(dāng)懷疑某個(gè)變異是新發(fā)異時(shí)，患者的雙親通常也要進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，若患者的雙親證實(shí)沒有攜帶相關(guān)變異，而他們的親緣關(guān)系是確定的情況下，患者所攜帶的變異即認(rèn)定為新發(fā)[10]。但是，當(dāng)主要的遺傳條件受到質(zhì)疑的情況下，患者的父母，兄弟姐妹、甚至遠(yuǎn)房親戚都應(yīng)該檢測(cè)，這主要取決于家系的特殊性以及家系成員之間的親緣關(guān)系。而在另外一些情況下，如果只針對(duì)患兒行CGES檢測(cè)，隨后對(duì)患病和非患病的親屬進(jìn)行基因型分型，如果可以表現(xiàn)出變異和疾病的共分離現(xiàn)象，也可以說明變異的致病性。
CGES可以發(fā)現(xiàn)已知的致病性變異和以前沒有報(bào)導(dǎo)過但對(duì)人類有明確致病性的基因變異。另外，部分實(shí)驗(yàn)室也報(bào)告一些新的基因突變，但是并不確定它是否可以引起人類疾病。因此，開展一些基因突變的致病機(jī)制研究顯得十分必要。
3 、CGES的結(jié)果評(píng)估
在部分CGES報(bào)告中，可以直接明確疾病的成因性變異；然而，有些報(bào)告中基因變異的意義需要由醫(yī)生和遺傳咨詢師共同來鑒別。實(shí)際上，在大多情況下，報(bào)告并沒能鑒別出看似合理的突變。
評(píng)估CGES結(jié)果最主要是要考慮到測(cè)序和臨床的正確性。分析的正確性是衡量患者是否真的攜帶CGES檢測(cè)結(jié)果中的特殊基因型，是由實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度決定的。而臨床的正確性則更復(fù)雜，更難評(píng)估，這取決于一種特殊的疾病是否是真正由特殊的基因突變所致以及這種突變是否有明確的致病性。
CGES的陽性發(fā)現(xiàn)往往是非常準(zhǔn)確的，但是假陰性率則根據(jù)基因組的區(qū)域不同而不同。正是這個(gè)原因，CGES才一直沒能真正替代可疑目的基因測(cè)序或者特定條件下優(yōu)化了的基因panels的測(cè)序[11]。大部分實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證CGES的陽性結(jié)果都是運(yùn)用PCR擴(kuò)增和Sanger測(cè)序。如果測(cè)序公司沒有對(duì)CGES的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，若要基于CGES結(jié)果實(shí)施醫(yī)學(xué)干預(yù)，那么實(shí)施之前都應(yīng)該運(yùn)用Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。
分析CGES數(shù)據(jù)的一般方法是將基因變異數(shù)據(jù)和已知的變異數(shù)據(jù)庫比對(duì)，進(jìn)而根據(jù)描述了變異和表型關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道分析。然而，在臨床醫(yī)生綜合分析測(cè)序結(jié)果時(shí)，應(yīng)該充分了解和疾病發(fā)生無關(guān)的變異，同時(shí)認(rèn)識(shí)到由于CGES測(cè)序是同時(shí)測(cè)出成千上萬基因的序列，所以測(cè)序結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤歸因的概率是較高的。
明確疾病特異性基因變異主要的臨床意義是對(duì)過去難以診斷的復(fù)雜疾病或遺傳疾病進(jìn)行診斷。有時(shí)，病因明確后可以給出特殊的治療策略并對(duì)臨床預(yù)后產(chǎn)生預(yù)想不到的改變。而在大部分情況下，致病基因的發(fā)現(xiàn)并不能改變臨床的治療策略以及預(yù)后，但是，它不僅可以為患者減少后續(xù)的一些昂貴的或者侵入性的檢測(cè)手段，還可以提供疾病再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估以及為患者及其親屬提供孕前干預(yù)或者胎兒的產(chǎn)前診斷。對(duì)于一些成年后發(fā)病的疾病來說，患者可以在在臨床癥狀出現(xiàn)前對(duì)致病性基因突變進(jìn)行檢測(cè)，還對(duì)有發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的兄弟姐妹進(jìn)行致病基因篩查和預(yù)防性治療來改善臨床預(yù)后。
4 、CGES結(jié)果解釋和溝通
臨床醫(yī)生需要綜合考慮由實(shí)驗(yàn)室遺傳學(xué)者提供的CGES結(jié)果，并將結(jié)果放在相關(guān)的醫(yī)學(xué)環(huán)境中分析。一個(gè)明確的基因變異可能的結(jié)局有以下幾種：1、提示患者過去的疾病既往史；2、提示患者還需要做一些額外的醫(yī)學(xué)檢查；3、揭示出過去沒有明確診斷的疾病綜合征；4、檢測(cè)出來的基因變異和患者的疾病本身無關(guān)。
在有些情況下，由臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室提供的CGES中，如果診斷出一個(gè)基因中的致病性突變（隱性遺傳疾病時(shí)為兩個(gè)），并且具有特異性時(shí)，便強(qiáng)烈提示該突變相關(guān)的遺傳疾病的診斷。實(shí)驗(yàn)室遺傳學(xué)者得出的結(jié)論是綜合了患者遞交的疾病相關(guān)臨床信息和測(cè)序后篩選出的突變相關(guān)疾病信息而得出[2]。在這種情況下，臨床醫(yī)生都還應(yīng)該先確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室報(bào)告給出的結(jié)論是否符合臨床，然后綜合相關(guān)醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)資源做出診斷，并告知患者以及患者家屬疾病基因的遺傳率、顯性率、表現(xiàn)型以及預(yù)后，以及可能為患者提供的特殊治療。
在其他一些情況下，實(shí)驗(yàn)室提供的CGES報(bào)告顯示一個(gè)或者多個(gè)候選基因變異或者測(cè)序結(jié)果中的變異并非與當(dāng)初開具此項(xiàng)檢查時(shí)想要檢測(cè)的表型相符。此時(shí)，如果檢測(cè)出來的變異中包含致病性突變，便要查閱大量的文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫，從候選的基因變異中篩選出致病性突變。這種測(cè)試后的臨床評(píng)估方法需要在遺傳學(xué)和生物信息學(xué)都非常精通的專家完成[16]，因?yàn)樽龊么祟愒u(píng)估，不僅要熟悉患者疾病的臨床特征以及鑒定出來變異或者基因的相關(guān)表型知識(shí)，還需要遺傳學(xué)家和疾病專家的共同商討以及他們對(duì)患者及其家系的研究。
如果CGES結(jié)果陰性，則可能促進(jìn)某些基因變異在知識(shí)水平上更新認(rèn)識(shí)，也就是過去在CGES報(bào)告中認(rèn)為是無法解釋的變異有可能是真正的致病性的突變。到目前為止，雖然對(duì)于CGES報(bào)告的再分析方法還沒有建立，但是未來仍然應(yīng)該定期對(duì)過去的報(bào)告進(jìn)行再分析以鑒定出過去未知的突變。另外，醫(yī)生要和一個(gè)患者家系溝通陰性結(jié)果報(bào)告很困難，因?yàn)榛颊呖赡芎茈y接受一個(gè)陰性結(jié)果的結(jié)局，畢竟CGES是一個(gè)大范圍篩查的昂貴的檢測(cè)項(xiàng)目。此時(shí)，最重要是要和患者或者患兒父母溝通說明，即便是一個(gè)陰性的CGES報(bào)告也不代表排除了致病性突變的可能。如果患者個(gè)人或者家系比較明確指向某種特殊的遺傳病，而CGES報(bào)告中卻沒有找到引起疾病或者可能引起疾病的突變時(shí)，應(yīng)該和患者解釋，該檢測(cè)技術(shù)并不是一個(gè)可以檢測(cè)到疾病相關(guān)的所有致病性突變的技術(shù)。
5 、意外數(shù)據(jù)的處理
CGES可以產(chǎn)生一些臨床上有價(jià)值但是與原始測(cè)序目的不相關(guān)的數(shù)據(jù)，這些結(jié)果可以避免患者日后做不必要的檢查。為此，美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)建議，臨床實(shí)驗(yàn)室要常規(guī)提供至少56個(gè)基因，24種疾病的特殊突變的查詢和報(bào)告[17]。有報(bào)道稱在接受CGES檢測(cè)的患者中有1~3%會(huì)有上述疾病相關(guān)的意外突變的發(fā)現(xiàn)[18]。一個(gè)具有專業(yè)知識(shí)的臨床醫(yī)生在鑒別某個(gè)疾病時(shí)也需要綜合患者及其家系的其他臨床表現(xiàn)，同時(shí)還必須有合適的遺傳咨詢和醫(yī)學(xué)服務(wù)才能得出結(jié)論。
6 、展望
對(duì)于很多臨床問題，CGES都是一種非常有價(jià)值的診斷方法，正在被臨床遺傳學(xué)家和其他的?？漆t(yī)生所應(yīng)用。我們?cè)诒疚乃信e的方法和應(yīng)用都在不斷的更新發(fā)展，臨床的各種疾病綜合征的相關(guān)數(shù)據(jù)越來越多，數(shù)據(jù)的解釋也在不斷更新改進(jìn)，CGES也不斷應(yīng)用在新的臨床領(lǐng)域（如新生兒科）。如果臨床醫(yī)生能夠在測(cè)試前和測(cè)試后作出很好的評(píng)估，同時(shí)熟知該檢測(cè)的局限性，那么CGES檢測(cè)報(bào)告價(jià)值將發(fā)揮到最大，臨床醫(yī)生也將越來越自信地將該項(xiàng)檢測(cè)運(yùn)用于臨床實(shí)踐中，讓更多的患者從中受益。
專家介紹
洪葵 ：留日醫(yī)學(xué)博士，留美醫(yī)學(xué)博士后，現(xiàn)任南昌大學(xué)二級(jí)教授，主任醫(yī)師，碩士生/博士生/博士后導(dǎo)師，南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科科副主任，心律失常病區(qū)主任，江西省分子醫(yī)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任。主要從事心律失常與心肌病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)和規(guī)范化防治、異常心電圖的機(jī)制解析研究。國家百千萬人才領(lǐng)軍人才“萬人計(jì)劃”獲得者, 教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)帶頭人。發(fā)表論文100余篇。以通訊或第一作者在SCI雜志發(fā)表論文37篇，影響因子累計(jì)達(dá)110分。
